EpiNext ChIP-Seq High-Sensitivity Kit (Illumina)
For streamlined ChIP sequencing NGS library preparation from low input cells
EpiNext 高敏感度免疫沉澱定序建庫套組
蛋白質- DNA 交互作用在細胞功能如訊息傳遞、基因轉錄、染色體分離、DNA複製和重組以及表觀遺傳緘黙化扮演關鍵角色。識別 DNA 結合蛋白的目標並了解蛋白質- DNA 交互作用的機制，在探討細胞生化反應過程中是重要的。染色質免疫沉澱 (Chromatin immunoprecipitation, ChIP) 接續次世代定序 (ChIP-Seq) 為研究全基因組的蛋白質- DNA交互作用提供了有利的工具。它允許在活細胞中檢測特定蛋白質結合的特定序列。特別是用於 Chip-Seq 針對各種轉錄因子 (transcriptional factors, TF) 的 ChIP 抗體，在全基因組轉錄因子結合位點分析是高度需求的。這種分析為了確實識別真正 TF-enriched 的區域要求 ChIPed DNA具有最小背景值。目前使用的 ChIP-Seq 方法在鑑定全基因組蛋白- DNA交互作用中發揮重要作用。然而，這些方法仍存在以下缺點：(1)需要大量的細胞/組織以獲得足夠的 DNA library，因此這些方法不能用於像是數量有限的腫瘤組織切片和胚胎組織等生物樣品；(2) ChIPed DNA的背景值較高；(3)過程費時 (3天以上) 且不方便。為解決這個問題，Epigentek 透過結合 microplate-based ultra ChIP 和高敏感度 DNA library 建構技術開發出 EpiNext ChIP-Seq High Sensitivity Kit (Illumina)。
EpiNext ChIP-Seq High Sensitivity Kit (Illumina) 是從哺乳動物細胞或組織開始進行 ChIP-Seq 所需的一完整試劑套組。此套組設計用於選擇性地富集來自各物種，特別是哺乳動物中染色質部分含有的特定 DNA 序列，並能製備用於像是Illumina Genome Analyzer II、HiSeq 和 MiSeq 系統等次世代定序 Illumina 平台的 ChIP-Seq library。此套組的優化流程和組件允許以最低的非特異性背景值抓取低含量的蛋白質/DNA 複合物，並且以減少的偏差快速建構 singleplexed 和 multiplexed 的 ChIP-Seq library。
引用文獻- Upadhyaya B et. al. (April 2017). Prenatal Exposure to a Maternal High-Fat Diet Affects Histone Modification of Cardiometabolic Genes in Newborn Rats. Nutrients. 9(4)
實驗原理
EpiNext ChIP-Seq High-Sensitivity Kit (Illumina) 包含從哺乳動物細胞或組織開始進行 ChIP-Seq 所需的全部試劑。在 ChIP 反應中，染色質從細胞/組織中分離出來，目標的蛋白-DNA 複合物使用感興趣的抗體進行免疫沉澱。之後清洗、釋出、沖提免疫沉澱的 DNA。套組中包含陽性對照抗體 (RNA polymerase II)、陰性對照的 non-immune IgG 和 GAPDH primer，其可作為陽性對照以證明此套組試劑和方法的效能。RNA polymerase II 被認為是富含 GAPDH 基因的promoter，預期能在多數生長的哺乳動物細胞中進行轉錄，且可與 RNA polymerase II 抗體但不能和 non-immune IgG 進行免疫沉澱。在製備 library中，ChIPped DNA 片段同時進行末端修復和 dA tailed (end polishing)。Adaptors連接到 polished DNA 片段的兩端以擴增和定序。使用 MQ binding beads 可選擇連接的 DNA 片段大小並純化，其允許快速和精確地篩選 DNA 尺寸。Size-selected DNA 片段用 high-fidelity PCR 混合物擴增，確保最小量的起始材料產出最大產量，並提供低錯誤率和最小偏差的高準確性 DNA library。
Workflow of the EpiNext™ ChIP-Seq High-Sensitivity Kit (Illumina).
Highly sensitive ChIP: The sheared chromatin isolated from different amounts of MBD-231 cells was used for ChIP-qPCR analysis of RNA polymerase II enrichment in GAPDH promoters.
Size distribution of library fragments. Ten nanograms of DNA was ChIPed by RNA polymerase II enrichment and used for DNA library preparation.
A ChIP-sequencing library was prepared using the EpiNext ChIP-Seq High Sensitivity Kit (Cat. #P-2030) from rat heart chromatin and polyclonal antibodies against H3K4me3 (Cat. #A-4033), H3(K9/14)ac (Cat. #A-4021) and H3K27me3 (Cat #A-4039). Sequencing was carried out on an Illumina HiSeq2500. Bioinformatics analysis of ChIP-seq is performed utilizing Bowtie and MACS. ChIP-seq reveals that the peaks of H3K4me3 and H3(K9/14)ac, which are indicators of gene activation presence in the exon CpG islands (CGI) of transcription factor gene Nr1h2 (nuclear orphan receptor member), while H3K27me3, which causes gene silencing, is not enriched in the same gene. It is reported that H3K4me3 is often enriched in CGI of orphan genes.產品列表
| 貨號 | 產品 | 數量 | |
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| P-2030-12 | EpiNext ChIP-Seq High-Sensitivity Kit (Illumina) 高靈敏免疫沉澱定序試劑套組(組) 廠牌:Epigentek | ||
| P-2030-24 | EpiNext ChIP-Seq High-Sensitivity Kit (Illumina) 高靈敏免疫沉澱定序試劑套組(組) 廠牌:Epigentek |
EpiNext ChIP-Seq High-Sensitivity Kit (Illumina)
- 優化的緩衝液和實驗方法克服 non-specific enrichment 的弱點，進而提高 ChIP反應的靈敏度和專一性，使 ChIP 的背景值降到最低。
- 透過使用塗在 strip-wells 上含有最大數量 IgG 結合區域的獨特嵌合蛋白質，可提高抗體選擇性和捕獲效率。這允許在廣泛的 pH 範圍內，不論是 monoclonal 或 polyclonal 的 IgG 亞型抗體都可強力結合。
- 目標 DNA 的高效率富集，陽性對陰性對照富集比率> 500。
- 高靈敏度和靈活性：可用於 singleplexed 和 multiplexed 的DNA library製備。起始細胞數量可少至 50,000 顆，範圍從 50,000 到 1,000,000 個細胞。廣泛的細胞/組織樣品皆可運用，包括有限或微量的可用染色質樣品。
- 快速流暢的程序：從細胞/組織到 DNA library 的過程不到7小時。 從 ChIPed DNA 到尺寸篩選的每個步驟皆不須 clean-up，所有反應都在相同的管中進行，進而節省時間、防止操作錯誤或有價值樣品的流失。 Gel-free 尺寸篩選進一步縮短準備時間。
- 非常便利：該套組包含 ChIP-Seq 每個步驟需求的所有組件，這些都適用於 ChIP和 ChIPed DNA library 的製備，進而使 ChIP-Seq 變為最方便的，且有可靠和一致的結果。
- 最小化的偏差：Ultra HiFi 擴增反應和任選的 PCR-free 步驟允許以最小的序列偏差和低錯誤率完成可重複高產量的 DNA library。
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